以下文章来源于EngineeringForLife ，作者EFL
3D打印技术能够直接制造出几何结构十分复杂的部件，因此受到研究人员的广泛关注。目前已开发出各种打印方法，如挤出打印、喷墨打印、立体光刻和粉末床融合等，这些打印方法通常用于打印不同的材料（包括热塑性塑料、液态光墨水和固态聚合物粉末等）。这些打印方法使用光或电加热作为能源，以逐层方式进行材料凝固。与传统的3D打印技术不同，体积打印（volumetric printing）技术将打印的对象分割成一系列体积元素，然后通过逐个体积元素的堆叠来创建最终的物体。这一过程使得立体打印技术更加灵活，能够以更高的精度和效率构建复杂的结构。现有的立体打印技术利用光在光学透明墨水体积中实现选择性光聚合来进行成型。然而，墨水本身对光的衰减、功能添加剂和已固化部件的阻碍都对光基立体打印的材料选择和打印尺寸造成了限制。虽然红外线（IR）光可将光的穿透力提高到几毫米，但要将光深入到生物组织等光学散射介质中在技术上仍具有很大的挑战性。
来自美国杜克大学的姚俊杰团队和美国哈佛医学院的张宇团队合作开发了一种自增强声波墨水设计和相应的超声打印技术，可实现深穿透声学立体打印（DAVP）。本工作利用实验和声学建模研究了与频率和扫描速率有关的超声3D打印原理。DAVP 具有低声流、快速声热聚合和大打印深度等优势，能够打印出各种形状的立体水凝胶和纳米复合材料，并且不受其光学特性的影响。DAVP 还能在生物组织中进行厘米级别深度的打印，这为微创医学铺平道路。相关工作以题为“Self-enhancing sono-inks enable deep-penetration acoustic volumetric printing”的文章发表在2023年12月07日的国际顶级期刊《Science》。
1. 创新型研究内容
本工作开发了一种相变粘弹性声波墨水（以下简称声波墨水），它同时具有深层声波穿透、低声波流和快速声热诱导自由基聚合等特性，从而实现了深层声波穿透立体打印（DAVP）（图 1A）。DAVP 利用粘弹性超声墨水中 FUS 焦点的声热效应实现材料的快速凝固，无需传统的支撑平台即可打印3D物体。在 DAVP 中，FUS 波向距离达 64 毫米（焦距）的局部区域传递压力高达几十兆帕的深穿透声能（图 1B）。由于高声压下的非线性声传播效应，椭圆形的小 FUS 聚焦区（声压场半高全宽：0.3 至 0.7 毫米）进一步缩小，这导致了快速、高分辨率打印性能（图 1C）。因此，DAVP 使我们能够精确地打印出几何形状复杂的材料，甚至可以打印出不透明和光学散射的材料。
图1 DAVP 的工作原理和自增强声波墨水的设计
（1）DAVP 原理和自增强超声墨水设计
传统上，超声介导的乙烯基水凝胶前体交联速度较慢，这是因为超声诱导空化产生的 ROS 浓度较低。此外，ROS 还能被强大的声流迅速淬灭或稀释。本工作的模拟结果表明，高粘度流体可显著降低声流速度（图 1D）。然而，高粘度墨水原料通常会表现出较高的声衰减，从而大大降低声波的穿透力。本工作假设，多组分粘弹性超声墨水应可抑制声流，同时促进快速声热效应，从而引发乙烯基前体的快速和空间自由基聚合，以实现深穿透3D打印方案。
为了配制这种用于概念验证的声波墨水，本工作选择了聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）的乙烯基低聚物作为基础成分，琼脂微粒作为流变修饰剂，聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAm）作为自增强吸声剂，过硫酸铵（APS）作为热引发剂。与 PEGDA 墨水相比，基于 PEGDA 的声波墨水（PEGDA/琼脂/PNIPAm，例如，20/10/3 wt % 比率）显示出更高的粘度，这是由于 PNIPAm 的发生了相变[转变温度 (Tt) = 34℃至 36℃]（图 1E）。在低剪切（0.05 Hz）条件下从 25℃ 加热到 40℃，声波墨水的粘度增加了 92 倍，从 2.0 Pa·s 增加到 185.3 Pa·s。同时，声波墨水显示出明显的剪切稀化现象，在 25℃ 条件下，100 赫兹剪切下粘度降低了 87%。这种声波墨水的设计理念适用于不同的配方，包括使用天然聚合物的乙烯基低聚物（如甲基丙烯酰明胶（GelMA））或具有可调转变温度（Tt,offset = 20.9℃ 至 38.5℃）的不同相变聚合物，以及添加各种纳米粒子的配方。本工作的超声墨水设计解决了声波穿透深度和声波流之间长期存在的难题。一方面，剪切稀化有利于在高频声波下实现深层声波穿透。另一方面，相变带来的粘度增强大大减少了声流。与 PEGDA 溶液中剧烈的流体流动相反，自增强超声墨水在 FUS 焦点处的流体流动可以忽略不计（图 1F），模拟结果也证明了这一点（图 1D）。
（2）DAVP 打印分辨率特征
本工作设计了一种3D FUS 打印机，它配备了三种超声频率（2.05、3.41 和 6.86 MHz）的 FUS 传感器、3D电动平台和打印控制系统。本工作首先研究了 DAVP 的单点打印分辨率。由于 PNIPAm 同时充当了自增声波吸收体和温度指示器的角色，因此在声波墨水中接触 FUS 后，会形成一个增白区域，并迅速扩展到 FUS 加热区之外。超声墨水表面的红外热图像显示，温度明显升高，形成了一个加热区（图 2A）。由于热扩散迅速，加热表面区域（直径达 4 毫米）大于 FUS 传感器的焦点区域（3.41 MHz 时为 0.45 毫米）。冷却后，在加热区中心形成了一块不透明的固体，未固化的声波墨水恢复了原来的颜色。通过比较固化尺寸和加热区温度曲线，本工作发现在 PEGDA 基声波墨水中添加 0.5 w/w% APS 的固化温度阈值为 Tc = 67℃。由于低功率累积式 FUS 的热扩散作用，固化尺寸随输入功率（或峰值声压）和曝光时间的增加而增大（图 2B）。正如本工作的非线性声学建模所示，非线性声学效应通过增加峰值压力和缩小焦点区域，导致 FUS 焦点处的声强升高。模拟还捕捉到了超声墨水中的非线性声传播，在远场显示出不同边界（如塑料和组织）的微弱反射和散射，而在超声墨水相变形成的界面上，声反射和散射可以忽略不计。利用数值模拟的温度图和测量的 Tc，本工作关注了单点固化尺寸（直径 0 至 4 毫米）的增大与峰值声压（35 至 55 MPa）和曝光时间（0 至 5 秒）的函数关系（图 2C）。由于反应速率提高，通过增加 APS 浓度，超声墨水的 Tc 很容易从 67℃ 降至 62℃。此外，增加 PEGDA 的浓度（40 wt %）可提高声波墨水的表观 Tc，这可能是由于聚合的放热效应产生了额外的加热，同时降低了粘度。
本工作通过在不同打印设置下连续扫描一条线，进一步研究了 DAVP 的打印分辨率。由于墨水内部的热扩散，在扫描 FUS 焦点的前端瞬间形成了一个不断扩大的加热区，这一点也得到了声热建模的证实（图 2D）。声波墨水只在加热区中心发生交联，温度升高超过固化阈值，形成各向异性的细丝。本工作还关注了固化尺寸与几个关键参数的关系，包括 FUS 焦点的扫描速度、FUS 频率和功率以及热扩散。建模结果显示，薄墨水槽（6 毫米）会导致热量在墨水槽边界积聚，而较厚的墨水槽（大于 10 毫米）则可以在焦点区域周围正常进行热扩散。因此，本工作使用 10 毫米厚的墨水槽来量化固化尺寸（或打印分辨率）（图 2E）。首先，提高扫描速度可以提高打印分辨率。由于热量积聚过多，在使用三种超声波频率（2.05、3.41 和 6.86 MHz）的低速扫描时观察到纵向尺寸过度固化（大于设计尺寸）。相比之下，在高速扫描时，由于两端温度上升不足，会出现固化不足（低于设计值）的情况。面内固化尺寸由 FUS 扫描速度和热扩散共同决定。例如，将扫描速度从 0.4 mm s-1 提高到 0.8 mm s-1 时，3.41 MHz 下的面内固化尺寸从 7.6 mm 减小到 1.6 mm。同样，轴向固化尺寸主要由 FUS 聚焦深度和热扩散决定。例如，6.86 MHz FUS 的聚焦深度（1.69 毫米）小于 2.05 MHz FUS 的聚焦深度（5.58 毫米），但声波墨水在 6.86 MHz 时的吸声率是 2.05 MHz 的 10 倍，因此加热效率更高。最终，在所研究的打印参数下，轴向固化尺寸范围为 5.0 至 9.9 毫米。
图2 DAVP 打印分辨率的特征
（3）体积结构和材料通用性的 DAVP
与传统的光基3D打印相比，深度穿透是 DAVP 的主要优势（图 3A）。例如，在黑色染色声波墨水（0.5 w/w%）中，室温下 2.05、3.41 和 6.86 MHz 超声波的穿透深度分别为 295.2、86.8 和 28.2 毫米，分别是 405 纳米光（Dp = 0.48 毫米）的 600、180 和 60 倍（图 3B）。因此，在轴向扫描速度为 1 mm s-1 和 3.41-MHz FUS 的条件下，染色声波墨水在 26 秒内就达到了 24 mm 的大固化深度，而染色光墨水在光固化 165 秒后仅获得了薄固体（2.4 mm）。无论墨水的光学特性如何，DAVP 的穿透深度都很大，这使我们能够在体积上打印出不同大小和几何复杂程度的非透明二维和3D水凝胶结构，包括带有尖角的字母和晶格、带有光滑表面和过渡的螺旋和血管。例如，以 3.41 MHz 的频率打印了 10 层蜂窝和血管网络（图 3C 和 D。复杂的3D手部模型（67 毫米 x 53 毫米 x 10 毫米）和蜘蛛模型（52 毫米 x 43 毫米 x 10 毫米）也是以 6.86 MHz 打印的（图 3E 和 F）。
使用染色的 PEGDA 基超声墨水，本工作打印出了不透明的彩色水凝胶复合材料，包括一组三个不同尺寸的齿轮和一个由三个彩色部件组成的组装车轮（图 3G）。改变 Tt 较高的相变聚合物，如聚（N-异丙基甲基丙烯酰胺）（PNIPMAm），可实现体温（37℃）下的打印。此外，使用荧光染色声波墨水（0.1 wt % 罗丹明 B）打印出了高保真分支血管网络形状（81 毫米 x 70 毫米 x 3 毫米）（图 3H）。此外，还利用由 10 wt % 纳米粘土组成的纳米复合超声墨水打印出四层树形（厚度为 2 毫米）（图 3I）。DAVP 还可用于打印基于蛋白质的生物材料，如使用基于 GelMA 的声波墨水打印出的韧性水凝胶心脏模型（图 3J）。以 NIH/3T3 成纤维细胞为模型细胞系，基于 PEGDA 和 GelMA 的声波墨水及其主要成分均显示出零至低的细胞毒性。在直接或间接接触声波墨水长达 30 分钟后，观察到的细胞存活率（>99%）与对照组（使用杜氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS））相似（图 3K 和 L）。此外，与在培养皿中培养的对照组相似，基于 GelMA 的水凝胶也能使播种后的不同类型哺乳动物细胞具有较高的存活率（>99%）以及健康的附着和增殖（图 3M），这表明它具有良好的生物活性。
图3 DAVP 性能和材料通用性
（4）用于穿透组织打印和微创医学的 DAVP
作为概念验证，本工作将 DAVP 应用于高速、高分辨率穿透组织制造和微创医学（图 4A）。首先，本工作展示了使用不同类型和尺寸的软组织进行活体穿透组织打印的情况。为了进行组织穿透打印，本工作将厚组织（最厚达 17 毫米）放在 FUS 近场的声波墨水腔顶部。以 2.05 MHz 的频率打印了一个骨形结构，穿过一个由皮肤层（3 毫米）、脂肪层（5 毫米）和肌肉层（7 毫米）组成的活体猪组织模型（图 4B）。通过 15 毫米厚的猪皮肤和肌肉组织或 17 毫米厚的猪肝组织打印出高保真蜂窝（图 4C）。同样，通过 17 毫米厚的猪肾组织打印出了中空的心形模型（图 4D）。
非瓣膜性心房颤动是一种常见的心血管疾病，与左心耳（LAA）有关。开胸手术或经导管手术可以封闭 LAA，降低血栓栓塞的风险。然而，手术关闭 LAA 侵袭性很强，而且治疗往往不彻底。本工作展示了 DAVP 辅助 LAA 关闭的概念验证（图 4E）。通过导管将声波墨水输送到置于打印室的活体山羊心脏的 LAA。然后使用3D FUS 打印机以 3.41 MHz 的频率通过 12 毫米厚的心壁将声波墨水凝固。精确的 FUS 聚焦扫描实现了声波墨水在整个 LAA 容积内的选择性固化，同时不损伤周围的心脏组织（图 S39 和影片 S11）。处理后，固化的水凝胶完全堵塞了 LAA，并与组织壁很好地粘合在一起，可以承受模仿心脏跳动的合理变形（图 4F）。
本工作进一步探索了 DAVP 技术在组织重建和再生方面的潜力，如治疗大面积骨缺损。例如，本工作配制了含有 5 w% 羟基磷灰石（HAp）纳米颗粒的 PEGDA/agar/PNIPMAm 纳米复合超声墨水，用于打印骨支架，以治疗骨缺损（图 4G）。用鸡腿制作了一个腓骨缺损模型（1 厘米长）。在注入纳米复合超声墨水之后，通过皮肤和肌肉组织（10 毫米厚）打印出含有 HAp 的光束状复合材料，以重塑缺损体积。超声波成像证实，纳米复合材料可与原生部位无缝粘合，重建骨骼，不会影响周围组织（图 4H）。
本工作还通过在肝脏病变部位打印药物洗脱填充物水凝胶，展示了用于治疗药物递送的 DAVP（图 4I）。Doxorubicin是一种临床化疗药物，可用于治疗乳腺癌和肝细胞癌等多种癌症（44）。配制了含有 1 mg ml-1 Doxorubicin的 PEGDA/agar/PNIPMAm 声波墨水，用于在 37℃ 温度下使用不同频率的 FUS 在肝脏病变部位打印化疗药物洗脱水凝胶。DAVP 成功实现了穿透组织打印和选择性固化，具体表现为水凝胶与组织的界面紧密结合（正面）以及对介入组织（背面）的烧灼几乎可以忽略不计（图 4J）。水凝胶中的药物逐渐释放并扩散到肝组织中（有效扩散率：8.7 × 108 cm2s-1），通过建模在 7 天内形成约 3 毫米厚的有效治疗层[浓度为 5.8 μg ml-1]（图 4K）。本工作预计，这种方法可用作消融后化疗，以改善癌症治疗效果。
图4 DAVP 用于概念验证穿透组织打印和微创疗法
2. 总结与展望
利用 FUS 波的深穿透能力、低声流和粘弹性自增强超声墨水的快速声聚合特性，本工作开发出了一种 DAVP 技术，它可以在没有打印平台的情况下以高打印保真度和分辨率进行立体打印。热响应自适应声波吸收器的使用解决了 FUS 曝光时声波流和深度穿透之间的矛盾。自增强超声墨水和非线性声波传播共同增强了 FUS 焦点处的声波加热，从而使材料快速、有选择性地凝固为结构单元。基于热累积的固化机制产生了毫米级的各向异性打印分辨率，通过优化 FUS 频率和扫描速度的打印参数以及使用共焦双传感器配置，可进一步提高分辨率。FUS 波的深层穿透力使不透明（纳米）复合材料的体积制造和厘米级厚组织的打印成为可能，而目前最先进的光基打印技术则无法实现这一点。自增强超声墨水设计可用于不同系统，极大地扩展了声学打印技术的候选材料数量。
文章来源：
www.science.org/doi/10.1126/science.adi1563
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