《Nature Communications》:高活性生物3D打印策略

可同步沉积细胞和生物材料的生物打印技术为组织再生领域注入了新的活力。然而，细胞在制造过程中不可避免地会受到损伤，而且生物打印细胞支架的机械稳定性较差，这些都严重限制了其应用。

来自中国科学院深圳先进技术研究院的阮长顺团队在心脏启发的空心水凝胶基支架（HHS）的基础上，提出了一种机械辅助的生物打印后策略，以快速、均匀、精确和友好的方式将细胞装载到 HHS 中。与静态条件下的细胞相比，HHS 在 4 秒内就能显示出对负载细胞的机械响应性，细胞数量增加了13倍，并能分区负载两种类型的细胞。作为概念验证，带有负载细胞的 HHS 在修复体内临界大小的节段性骨质缺损和骨质疏松性骨质缺损方面显示出更强的再生能力。本研究团队期待这种生物打印后策略能为促进基于细胞的再生疗法提供一种通用、高效且前景广阔的方法。相关工作以题为“A mechanical-assisted post-bioprinting strategy for challenging bone defects repair”的文章发表在2024年04月26日的国际顶级期刊《Nature Communications》。
1. 创新型研究内容

本研究提出了一种生物打印后策略，即在支架制作完成后，通过机械辅助立即装载细胞（图 1a）。一种受心脏启发的空心水凝胶支架（HHS）可对外部机械刺激做出可逆反应，用于主动装载细胞，且损伤最小，类似于心脏收缩和舒张时的心脏冲动。基于甲基丙烯酰明胶、Laponite 纳米粘土和 N-acryloyl 甘氨酰胺的定制组合，HHS 首次通过一步同轴打印制成，无需任何辅助材料。利用这种混合油墨的优势，可以很容易地制造出具有均匀完整的中空丝状结构的高保真大尺寸 HHS，而且其结构具有很高的可调性。有趣的是，由于具有中空结构，HHS 具有极佳的回弹性、快速的形状恢复能力和优异的抗疲劳性，这使其能够快速、均匀、精确地对负载单元做出卓越的机械响应。此外，还在大鼠身上验证了细胞负载型高密度聚合材料修复临界大小节段性和骨质疏松性骨缺损的能力，结果表明细胞负载型高密度聚合材料在修复具有挑战性的骨缺损方面表现出令人满意的能力。总之，这项工作为组织工程中细胞和生物材料的功能组装提供了一种可靠的方法。

【制造大型精密 HHS】

在不使用任何辅助材料的情况下，使用同轴针直接通过挤压打印技术制作 HHS（图 1a），这为制作形状复杂的大型组织工程构建体提供了便利（图 1b）。经紫外线照射固化后，获得了稳定的 HHS，其形状保真度高，可悬浮于水中。结果表明，本研究可以清楚地观察到空的通道（图 1c），从而证明了 HHS 中空结构的可行性。要制备 HHS，具有良好打印性、适当机械性能和生物相容性的水凝胶墨水必不可少。根据本研究团队之前的研究 ，明胶甲基丙烯酰/皂石纳米粘土/N-丙烯酰甘氨酰胺的混合油墨表现出优异的可打印性和足够的机械性能，可用于管状组织再生的微管同轴打印。
【可调中空结构和 HHS 网格】

如图 2a 所示，本研究首先定义了内径和外径（分别为 d 和 D）、一层中两根中空细丝之间的最近距离（L）、HHS 中细丝中空空间的体积（V1）以及网格内部的体积（V2）。在 HHS 中，大部分由 GLN 水凝胶填充，而 V1 和 V2 则代表中间的空间。如图 2b、c所示，可以清楚地观察到光滑均匀的中空细丝、中空结构的完整性以及不同网格的高保真性，而且它们的 L、D 和 d 是可调的，以调节 HHS 的能力。Lx（x 范围为 0.2 至 0.8 毫米）可通过 GeSiM Robotics 软件中的模具设计轻松调节，而 Dy（y 范围为 0.4 至 0.8 毫米）、dz（z 范围为 0 至 0.6 毫米）和中空丝壁厚 Dy - dz（范围为 0 至 0.4 毫米）则可通过调节同轴喷嘴的外部和内部针头尺寸来调节。此外，图 2c 进一步显示了不同参数组合的 HHS，图 2d 则总结了其详细分析，表明打印的HHS 具有出色的可设计性。
【HHSs 的可压缩性、回弹性、形状恢复和抗疲劳性】

通过压缩和循环压缩试验，本研究全面探究了中空丝中 d 对 HHS（LDdz）力学行为的影响。如图 3a(i)所示，随着 d 的增加，HHS 的压缩强度提高，而压缩模量降低；HHS（L0.4d0.6d0.3）和 HHS（L0.4d0.6d0.4）可以承受高达 80% 应变的压缩而不断裂，但 HHS（L0.4d0.6d0）和 HHS（L0.4d0.6d0.2）分别在约 47% 和 65% 应变时断裂。图 3a(ii)进一步证明了 HHS（L0.4d0.6d0.3 和 L0.4d0.6d0.4）的弹性，这些大 d 的 HHS 即使在 80% 应变后也能恢复到初始状态并保持完好无损。此外，在图 3b中，HHS 的恢复速度可通过发光来观察。HHS（L0.4d0.6d0.3）在受到轻微挤压后出现明显变形，并在移除挤压后立即恢复原状，同时完全吸收发光液体。特别是，一个周期的手动加压和形状恢复仅需 4 秒钟，而快速恢复仅需 1 秒钟，这与心脏收缩和舒张所产生的心脏冲动相似。随后，本研究通过应变为 40% 的循环压缩-恢复试验，测定了 HHS 的可重复使用性和抗疲劳性（图 3c，d）。结果表明，应力与d呈负相关。一旦经历102次循环，滞后面积急剧下降，表明HHS（L0.4d0.6d0）发生了严重破坏；而HHS（L0.4d0.6d0.4）的滞后面积没有明显下降，HHS（L0.4d0.6d0.3和L0.4d0.6d0.4）甚至在经历104次循环后仍能恢复到初始状态并保持完好。结果表明，HHS 的抗疲劳性能可通过增加 d 得到提高，尤其是 HHS（L0.4d0.6d0.3 和 L0.4d0.6d0.4）具有优异的抗疲劳性能（图 3e）。综上所述，由于其中空结构，HHS 具有良好的可压缩性和回弹性、快速的形状自我恢复能力以及优异的抗疲劳性。
【HHSs的机械响应能力】

由于其特殊的机械特性，HHS 适合作为组织工程支架，通过适当的机械刺激主动吸收生物活性物质（如生长因子、细胞）。为进一步探索其机械响应性，本研究制备了具有可调 dz（L0.4d0.6dz，z = 0、0.2、0.3、0.4）和 Lx（Lxd0.6d0.4，x = 0.2、0.4、0.6）的 HHS。通过将 HHS 浸入水中并施加或不施加机械刺激，对其机械响应性进行了评估。如图 4a、b 所示，在没有机械刺激的情况下，HHSs 显示出相似的吸水趋势：HHSs 的吸水率在最初 5 分钟内急剧上升，随后随着时间的推移保持不变，与 L 呈正相关，但与 d 保持不变。在没有机械刺激的情况下，GLN 水凝胶在一段时间内几乎不吸水，而 HHS（LDd0）的吸水趋势与上述其他具有中空结构的 HHS 相似，这表明它们的吸水能力取决于网格，而不是 GLN 水凝胶的溶胀或 HHS 的中空结构（图 4c）。HHS 的吸水率与 V2 的理论体积比大致对应。以 HHS（L0.2d0.6d0.4）为例，V2（27.7 ± 5.4%）与吸水比（27.6 ± 0.5%）接近。因此，可以得出结论：在静态条件下，V2的空间是影响 HHS 吸水率的主要因素。
【HHSs 快速、均匀、精确的细胞装载能力】

本研究开发了一种机械辅助生物打印后策略，利用 HHS 的快速压缩恢复能力和优异的机械响应性，实现快速、均匀和精确的细胞负载。如图 5a、b 所示，与静态条件相比，在 80% 应变下，HHSs 在 4 秒钟的压缩-恢复周期内细胞数量显著提高了约 13 倍，这表明本研究提出的策略通过 V1 机械响应具有活性和有效性。培养 3 天后，HHS 中的负载细胞表现出均匀沉积和明显增殖。同时，HHS 中负载细胞的数量随着压缩应变（图 5c）或循环次数（图 5d）的增加而增加，这表明本研究提出的策略具有可控性。此外，更大尺寸的 HHS（15 × 15 × 10 mm 和 20 × 10 × 10 mm）也能在 80% 应变的 4 秒钟内，在压缩-恢复的循环下快速加载细胞。此外，在机械刺激（分别为 80% 应变或 10 个压缩-恢复周期）后，对细胞的线粒体膜电位、活性氧（ROS）和增殖进行了检测，结果证明机械刺激对细胞的活力没有负面影响。因此，这种将细胞装入 HHS 的生物打印后策略对细胞友好且方便。
【HHSs 细胞对高难度骨缺损的体内修复】

本研究在大鼠临界大小节段性骨缺损和骨质疏松性骨缺损模型中评估了 HHS 细胞修复骨缺损的能力。首先，通过在大鼠皮下植入 HHS-M（含有 rBMSCs 的 HHS），对其炎症和异物反应进行了评估。结果表明，与不含细胞的 HHS 相比，HHS-M 没有表现出过度的炎症和异物反应。对体内含有荧光素酶表达的 rBMSCs 的 HHS-M 进行的生物发光图像和定量分析表明，尽管有一部分播种的细胞死亡，但大部分播种在 HHS 中的细胞都能存活。实验示意图见图 6a。从图 6b 中的 X 射线图像来看，空白组、HHS 组、HHS-M 组（HHS 与 rBMSCs）和 HHS-ME 组（HHS 与 rBMSCs 和 rECs）在 6 周时均未观察到桥接，而 HHS-M 组和 HHS-ME 组在 12 周时观察到完全桥接。如图 6c 所示，µCT 图像的3D重建直观地反映了新形成血管和骨骼的形态特征。术后 6 周，显微胶片灌注结果显示，与 HHSs 和 Blank 相比，HHS-细胞（尤其是 HHS-ME）中有更多新形成的有序血管。术后12周，HHS-M组和HHS-ME组均有大量新骨形成，并可清晰观察到管状和杆状结构桥接股骨缺损的近端和远端，表明新骨可在HHS-M组和HHS-ME组内形成（图6c）。图 6d 总结了从重建的 μCT 图像中得出的缺损内骨量（BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）的量化结果。从 6 周到 12 周，4 组的 BV 都有明显增加（图 6d）。在 12 周时，与空白组和 HHS 组相比，HHS-M 组和 HHS-ME 组的 BV 水平在统计学上都更高，HHS-M 组和 HHS-ME 组的 BV 分别是 HHS 组的 2.1 倍和 2.5 倍。HHS-M 组和 HHS-ME 组的 Tb.Th 也比 Blank 组和 HHS 组明显增加。四组之间的 Tb.N 没有差异。如图 6e 所示，血红素和伊红（H&E）以及马森三色染色进一步证实，HHSs-细胞（HHS-M 和 HHS-ME）能明显改善新骨的重建，而且 HHS-ME 在促进骨再生方面似乎略优于 HHS-M。
为进一步研究 HHS 细胞在骨质疏松条件下的骨再生能力，将圆柱形支架植入骨质疏松大鼠股骨骺缺损处。手术 4 周和 8 周后，HHS-M 组观察到大部分新骨形成，而 Blank 组效果最差，即使在 8 周后，从内部仍有明显的空白区域来看（图 7b，d）。如图 7b 所示，手术 4 周和 8 周后的新骨形成情况可通过 μCT 进一步观察。值得注意的是，HHS-M 组在松质骨缺损区域可以看到大量新骨形成，而 Blank 组即使在术后 8 周也几乎看不到新骨信号。图 7c 总结了从重建的 μCT 图像中得出的骨量与总缺损量之比（BV/TV）、Tb.N 和缺损内小梁分离（Tb.Sp）的量化结果。BV/TV和Tb.N的结果显示，HHS-M组在所有时间点的水平均高于HHS组和空白组，8周时的顺序为HHS-M > HHS > 空白。HHS组和HHS-M组的Tb.Sp明显下降，其中HHS-M组的Tb.Sp最低。H&E和Masson三色染色结果（图7d）显示，HHS-M组在4周和8周时新骨形成最多，这与μCT图像的结果一致。
2. 总结与展望

总之，通过一步同轴打印的简单方法，在不使用辅助材料的情况下，本研究成功地制造出了一系列具有可调中空结构的大尺寸精密 HHS。所获得的 HHS 具有出色的机械性能：诱人的回弹性、快速的形状恢复和优异的抗疲劳性，显示出其极强的机械响应性。利用这种独特的响应性，可进一步实现快速、均匀、精确和友好地将细胞装入 HHS。此外，负载细胞的 HHS 还能在体内有效修复临界大小的节段性和骨质疏松性骨缺损。因此，这种机械辅助后生物打印策略为基于细胞的再生疗法提供了一种通用、高效且前景广阔的方法。

文章来源：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-48023-8