GelMA临床应用｜3D打印载药隐形眼镜状贴片治疗细菌性角膜炎

细菌性角膜炎是当前发病率和致盲率最高的感染性角膜病，目前使用氟喹诺酮类滴眼液进行治疗，存在药物利用度低、耐药性和频繁用药导致患者用药依从性困难等难题。本文主要讲述了一种采用3D打印载药隐形眼镜状贴片治疗细菌性角膜炎的治疗策略。

细菌性角膜炎

细菌性角膜炎(Bacterial Keratitis)是由细菌感染引起的、角膜上皮缺损及缺损区下角膜基质坏死的化脓性角膜炎，又称为细菌性角膜溃疡，起病急，发展迅速，如感染未得到控制，可导致角膜穿孔，甚至眼内炎，是当前发病率和致盲率最高的感染性角膜病。隐形眼镜的使用、激光眼角膜手术、角膜损伤、长期使用免疫抑制药物、眼外伤和其他眼部疾病是细菌性角膜炎发病的一些重要危险因素。其常见致病菌包括假单胞菌﹑表皮葡萄球菌﹑金黄色葡萄球菌及肺炎球菌等。细菌性角膜炎的治疗原则是：去除病因，积极抗炎治疗，防止病灶蔓延扩大，并促进其痊愈。首选广谱抗生素滴眼液进行治疗，如药物不能控制感染应果断手术治疗。

眼药水治疗的局限性

在治疗细菌性角膜炎的方案中，抗生素眼药水是首选药物，但由于其低生物利用度和短暂的接触时间，需要频繁使用。如急性期频繁滴眼，每15~30min一次；严重病例，在开始的30min，每5min滴药一次。尽管眼药水的生物利用度只有1-5％，但市场上约90％的眼科药物是眼药水。频繁使用眼药水可以克服生物利用度低的问题，但也会导致患者遵从困难，从而影响预后，并且氟喹诺酮类眼药水的频繁使用会增加多重耐药性的风险。

3D打印载药隐形眼镜状贴片

制备甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和甲基丙烯酰化壳聚糖（ChiMA）混合水凝胶，并搭载S100钙结合蛋白A12（S100A12）抗菌肽（AMPs），通过3D打印制备具有黏附性的隐形眼镜状贴片（Contact Lens-like Patches，CLP）。
抗菌肽已经成为克服多药耐药性挑战的潜在策略。它们具有广谱的抗菌活性，并具有快速杀菌、抗生物膜活性、低细胞毒性和细菌产生抗药性的机会较小等优点。
制备10% w/v四种比例的生物墨水：100% GelMA、90% GelMA: 10% ChiMA（GC90）、75% GelMA: 25% ChiMA（GC75）、50% GelMA: 50% ChiMA（GC50），向GelMA-ChiMA (GC)生物墨水中加入S100A12抗菌肽，剧烈搅拌1小时。采用挤压型27G打印机针尖，打印速度10mm/s，压力为40-60 KPa，80%填充密度。设定CLP的基本建模值为直径15 mm，厚度0.3 mm。根据上述参数，使用添加AMP的生物墨水进行3D打印，将打印完成的CLP暴露于365 nm的紫外下，光聚合2 min。

隐形眼镜状贴片（CLP）的理化表征

CLP的孔起着重要的作用，因为它们有利于治疗药物的迁移，并有助于随后附着在细胞膜上。水凝胶的多孔性也提供了高比表面积，这有助于伤口愈合和其他炎症状况，在作用部位提供了简单的必需营养物质和氧气交换。所有水凝胶的孔径和孔隙率都随ChiMA浓度的增加而增加。表1数据表明，GC50由于GelMA和ChiMA的高吸水能力，表现出高孔径和高孔隙率。同时CLP的溶胀比决定水凝胶溶胀平衡时重量增加的多少。高溶胀比有利于活性成分向目标部位的迁移，保持角膜的水分，并防止干眼症的形成。
CLP的渗透性

角膜特别容易被感染，因为它的粘膜表面很潮湿，并且持续地暴露在外部环境中，因此它很容易受到各种微生物的影响。角膜紧密连接的完整性决定了该屏障在防止微生物入侵方面的有效性。上皮细胞之间的紧密连接限制了液体、分子和离子在它们之间的移动。上皮膜显著地阻碍了物质从眼睛到前房的自由扩散。

跨内皮/上皮电阻抗（TEER）测量是评价和监测跨细胞层的电阻，以此确定细胞层完整性和通透性的一种办法。通过研究TEER来测量人角膜内皮细胞（HCE）单分子层的屏障完整性和渗透性，结果表明，GelMA100、GC90、GC75和GC50（500）的水凝胶的渗透率分别为123.33 ± 2、123.13 ± 1、114 ± 1和112 ± 1.52 Ω cm2。与其他配方相比，GC50（500μg AMP）配方具有最高的膜渗透性。GC水凝胶不仅能够破坏细胞的单层，GC50（500μg AMP）还能深入多层上皮细胞层，恢复到正常状态而不损伤任何细胞。这是由于支架中存在壳聚糖，它已被作为跨上皮药物递送系统的新型赋形剂。壳聚糖会导致膜相关紧密连接蛋白ZO-1（Zonula occludens-1 ）从离散区域丢失，会破坏细胞间的紧密连接，从而促进活性成分的渗透，并通过细胞内摄取和细胞间途径增加对角膜的渗透。

CLP的体外抗菌实验

将支架置于游离铜绿假单胞菌（106 CFU/mL）中孵育24 h，测定了装载500µgAMP的GelMA100 CLP和GC90/75/50 CLP的杀菌效果。24 h后，将细菌稀释后置于固体琼脂平板上，测定CFU值。从图2A结果中可以看出GC50（500µgAMP）CLP的抑菌效果最好。
表2中数据表明，不含AMP的GC50 CLP的抑制区（Zone of inhibition，ZOI）为18±0.3 mm，说明配方中的壳聚糖也有抑制作用。CLP中壳聚糖的存在，对抗菌活性有额外的影响，表现出协同效应。壳聚糖对细菌的抑制机制主要涉及对细菌细胞质膜的破坏，因为壳聚糖具有阳离子基团，而细菌的细胞壁包含带负电荷的表面。这种结合机制破坏了细菌的细胞质。
CLP的体内抗菌实验

用细菌性角膜炎的兔模型进行体内实验，家兔分为对照组、游离抗菌肽和配方组：AMP (100μg)、GelMA100 (100μg AMP)，GC50 (100μg AMP)、GC50 (500μg AMP)。使用局部麻醉盐酸利多卡因应用于兔角膜表面，然后使用30号针将铜绿假单胞菌（20µL，103 CFU/mL）注射到兔角膜，确认各组右眼均感染细菌性角膜炎。对照组不作治疗，游离抗菌肽组每6h用100µg的AMP处理，而配方组用负载AMP的3D打印CLP处理，将其放置在每个角膜上。每12小时重复一次治疗周期，直到观察到显著的治疗效果。每次治疗前，对各组家兔的眼睛进行分析，给予临床评分（0-5分）。治疗后对家兔进行安乐死，解剖角膜，无菌取出，保存在含有pH=7.4 PBS的穿刺管中。使用高速匀浆器在25000 rpm下均质2min。样品被稀释并涂布在琼脂平板上，34ºC孵育12-18h。通过计数在平板上形成的菌落来确定活菌的数量。
图3的结果表明，GC50（500μg AMP）CLP的临床评分明显低于其他治疗组，且显著降低了角膜的细菌负荷。相比之下，使用游离的S100A12作为局部滴眼液。结果显示，铜绿假单胞菌菌落计数（CFU/ mL）较高，说明治疗方案无效，不能穿透眼部和细菌细胞膜。

负载AMP的CLP在克服细菌多药耐药（MDR）和消除与眼药水相关的频繁给药方面具有很大的潜力。配方中壳聚糖的存在对AMP破坏细菌生物膜具有协同作用。AMP的剂量还可以根据患者感染的严重程度来控制，这表明它们可以作为个性化药物使用。3D打印的易用性将为根据患者细菌性角膜炎的严重程度优化剂量开辟新的途径。

本文主要内容编译自印度博拉理工学院药学系纳米医学研究实验室最新发表在WILEY的文章: 3D-Printed Inherently Antibacterial Contact Lens-like Patches Carrying Antimicrobial Peptide Payload for Treating Bacterial Keratitis¹. 


参考文献

1.Sanjay Ch, et al. (2024) 3D-Printed Inherently Antibacterial Contact Lens-like Patches Carrying Antimicrobial Peptide Payload for Treating Bacterial Keratitis. Published 2024 Jan 22. doi:10.1002/mabi.202300418